Detecção de Ralstonia solanacearum em plantas infectadas de eucalipto via PCR em tempo real

Abstract

A murcha bacteriana causada por Ralstonia solanacearum é, atualmente uma das mais importantes doenças bacterianas na eucaliptocultura. O uso de mudas clonais sadias é ométodo mais efetivo para evitar a introdução e disseminação do patógeno em áreas livres da doença. Plantas infectadas podem ser identificadas visualmente ou pela exsudação de pus, porém, em minicepas assintomáticas, mas com infecções latentes, nas quais o xilema apresenta baixas concentrações de células bacterianas, não é possível a visualização de sintomas de murcha ou sinais da doença como a exsudação bacteriana. Assim, para certificação de que as mudas para o plantio estão livres do patógeno, é necessário empregar um método capaz de detectar a bactéria, mesmo quando presente em baixas concentrações.Assim, o presente trabalho objetivou avaliar a PCR em tempo real para detecção da bactéria no período latente de infecção. Primeiramente, dentre seis oligonucleotídeos testados, o oligo 224R/224F, que amplifica a região do gene ribossomal 16S, foi o único específico para R. solanacearum. Subsequentemente desenvolveu-se um protocolo de extração de DNA bacteriano a partir do tecido vegetal infectado que consiste da maceração com nitrogênio líquido, adição de solução salina, centrifugação, descarte do sobrenadante e extração com o kit (Promega) de extração. Para avaliar o método da PCR em tempo real, mudas de eucalipto de quatro clones foram inoculadas com o isolado UFV32 de R. solanacearume o DNA do patógeno foi quantificado aos 20 dias da inoculação. Aproximadamente 10 5 a 106 unidades formadoras de colônia (ufc)/g de R. solanacearum foram detectadas.. O limite de detecção da PCR em tempo real foi de 103ufc/g contra 107ufc/mL da PCR convencional, ou seja 10.000 vezes maior.. O método mostrou-se eficiente na detecção e quantificação de R. solanacearum diretamente do tecido vegetal de eucalipto.

Bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum is currently one of the most important bacterial diseases in eucalyptus. The use of healthy eucalyptus cuttings is the most effective method to prevent the introduction and spread of the pathogen in disease free areas. Infected plants can be identified visually bybacterial cell exudation from the host tissue and confirmed by analysis of PCR. However, in asymptomatic minicuttings with latent infections, in which the xylem shows low concentrations of bacterial cellsit is not possible to visualize wilting symptoms bacterial exudation. Thus, for certification thateucalyptus cuttings are pathogen free, it is necessary to employ a sensitive method able to detect the bacteria, even when present in low concentrations in the host tissue.This study aimed to evaluate the real-time PCR for detection of bacteria in the latent period of infection. Among six primers previously tested, only the oligo224R/224F was specific to R. solanancearum, that amplifies the r16S ribosomal gene region. Subsequently,it was developed a protocol to extract bacterial DNA from infected plant tissue consisting of tissue maceration in liquid nitrogen, addition of saline solution, centrifugation, discard of the supernatant and DNA extraction. Real-time PCR of fourinfected eucalyptus cuttings with R. solanacearum(UFV32)evaluated at 20 days after inoculationshowed 105 to 106 colony forming units (cfu) of R. solanacearum / g of host tissue. The detection limit of real-time PCR was 103cfu / g, copared with 107cfu / mL for the conventional PCR. The method proved to be efficient for detection and quantification of R. solanacearum directly from infected eucalyptus plant tissue.