Efeito do estresse pelo frio sobre células embriogênicas de Araucaria angustifolia em cultura: disfunção mitocondrial e estresse oxidativo

Abstract

Araucaria angustifolia (Bert.) Kuntze é uma conífera do sul do Brasil que tem seu desenvolvimento intimamente ligado ao clima. Esta gimnosperma é encontrada em regiões de clima temperado úmido, com temperaturas mínimas abaixo de 0°C em algumas regiões. O conhecimento dos fatores fisiológicos e bioquímicos que influenciam o crescimento e o desenvolvimento da araucária é fundamental para o entendimento do comportamento da espécie frente a diferentes condições ambientais, fornecendo subsídios para a sugestão de práticas de reflorestamento e regeneração natural da espécie. Aumentos nos níveis de espécies reativas de oxigênio têm sido descritos em plantas expostas a baixas temperaturas. A cadeia transportadora de elétrons de mitocôndrias de planta é uma importante fonte de ROS. No entanto, estas organelas possuem sistemas enzimáticos que são capazes de impedir a produção de ROS e, também, de promover a sua remoção, como a PUMP, AOX, NADP(H) desidrogenases e algumas enzimas antioxidantes. No presente estudo, culturas de células embriogênicas de Araucaria angustifolia foram submetidas ao estresse pelo frio (4°C durante 24 h ou 48 h) e foram avaliados a viabilidade celular e, em mitocôndrias isoladas, a atividade da PUMP, AOX, catalase, SOD, APX e GR, níves de ROS e lipoperoxidação. A viabilidade celular, avaliada pelos métodos do azul de Evans, do FDA mais IP e do MTT, não foi afetada pelo frio. Em mitocôndrias isoladas das células estressadas, a atividade da PUMP aumentou em ~50% (24 h e 48 h), como determinado pelos ensaios de consumo de oxigênio, após a adição de ácido linoleico e a inibição por BSA mais ATP. Esta ativação foi confirmada pelos ensaios de potencial elétrico de membrana (). Por outro lado, a atividade da AOX não foi alterada, como demonstrado pelos ensaios de consumo de oxigênio (insensível a cianeto e sensível ao SHAM). Em relação a AOX, foi identificado um segmento conservado de 444 pb no exon 3, que a classifica como AOX1. Quanto as enzimas antioxidantes, o estresse pelo frio (4°C) causou um aumento na atividade da catalase em 24 h (~32%), diminuição da GR (~15%) e nenhum efeito sobre a SOD e APX. Já o estresse por 48 h promoveu a diminuição das atividades da catalase (~57%), da GR (~15%) e nenhum efeito sobre a SOD e APX. Os níveis de ROS, determinados em ensaios com a sonda DCF-DA, foram aumentados no estresse 24 h e 48 h em ~25% e ~15%, respectivamente. A lipoperoxidação, avaliada pela medida de TBARS, aumentou em ~24% após o estresse de 48 h. Os resultados deste estudo sugerem que o estresse pelo frio, apesar de não comprometer a viabilidade das células de A. angustifolia, promove o aumento dos níveis de ROS, e que o estímulo da PUMP e da catalase mitocondrial fazem parte da resposta destas células a esta condição.

Araucaria angustifolia (Bert.) Kuntze is an endangered native conifer from southern Brazil that has its development closely related to climate. This gymnosperm is found in humid temperate regions, with minimum temperatures below 0°C in some regions. Physiological and biochemical knowledge regarding the growth and development of araucaria is fundamental to understanding the behavior of the species in response to different environmental conditions, thereby supporting reforestation and natural regeneration practices. Increased ROS levels have been reported in plants exposed to cold stress. The electron transport chain of plant mitochondria is an important source of reactive oxygen species (ROS) in the cell. However, these organelles possess enzymatic systems that are able to prevent ROS production or promote their detoxification including NAD(P)H dehydrogenases, AOX and PUMP as well as antioxidant enzymes. In this study, embryogenic cell cultures of Araucaria angustifolia were subjected to cold stress (4°C for 24 h or 48 h) and the cell viability was determined. In isolated mitochondria the activities of PUMP, AOX, catalase, SOD, APX and GR were evaluated, and the levels of ROS and lipid peroxidation were measured. Cell viability, evaluated by Evans blue, FDA plus IP and MTT methods, was unaffected by cold stress. In the mitochondria of stressed cells, PUMP activity increased by approximately 50% (at 24 h and 48 h), which was determined by measuring oxygen consumption after the addition of linoleic acid and inhibition by BSA plus ATP. PUMP activation was confirmed using transmembrane electrical potential () assays. AOX activity was not modified in the mitochondria from stressed cells, as demonstrated by unaltered oxygen consumption in the presence of cyanide-resistant and sensitive to salicylhydroxamic acid (SHAM). Also regarding AOX, a conserved region of 444 pb in exon 3 was identified, which classifies it as AOX1. Cold stress (4°C, 24 h) did not affect SOD and APX activities; however, catalase and GR had their activities increased and decreased by ~32% and ~15%, respectively. After 48 h of cold stress, similar effects were observed for APX and SOD but catalase and GR were inhibited by ~57% and ~15%, respectively. ROS levels, determined in assays using DCF-DA, were increased by ~25% after 24 h and by ~15% after 48 h stress. Lipid peroxidation, evaluated by measuring TBARS, was increased by ~24% after 48 h of stress. These results suggest that although cold stress did not compromise the viability of cells of A. angustifolia it is able to promote the increase of ROS. The results also indicate that the stimulation of mitochondrial catalase and PUMP are important responses of these cells to this condition.