Embriogênese somática e isolamento de protoplastos de pequizeiro

Abstract

O pequizeiro é uma das espécies frutíferas nativas do Cerrado de maior potencial econômico e ecológico e de grande importância social. Nas últimas décadas, grandes extensões de terra no Cerrado têm sido incorporadas ao sistema agrícola. Este fato, aliado à baixa taxa de regeneração natural, tem levado ao declínio de populações naturais da espécie. Em vista disso, estudos de técnicas de propagação para a produção de mudas visando ao plantio racional da espécie e recuperação de áreas degradadas tornam-se necessários. O presente trabalho foi realizado com o objetivo de estudar o cultivo in vitro do pequizeiro por calogênese, organogênese, embriogênese somática e isolamento de protoplastos. Foram testadas, para indução de embriões somáticos e calos embriogênicos, combinações de concentrações de 2,4-D x sacarose e 2,4-D x 2-iP. Para o desenvolvimento de embriões foi testado o ABA. Quanto ao isolamento de protoplastos, foram testadas duas soluções enzimáticas, tempo de incubação, concentrações de manitol e sistema de incubação (estacionário e agitação orbital). Para o cultivo in vitro foram testadas combinações de concentrações de BAP x ANA e de cinetina x picloran. Foi testado também o cultivo em meio líquido e sólido e na presença e ausência de luz. De acordo com os resultados, obtiveram-se embriões e calos embriogênicos aos 45 dias de cultivo e de calos embriogênicos em subcultivo aos 45 dias com o uso de 60 g L -1 de sacarose em meio MS. Obtiveram-se 18,32 x 10 5 ±1,18 protoplastos por grama de massa fresca de tecido foliar obtido in vitro, com diâmetro médio de 25,19 ±4,75 μm. Utilizou-se solução enzimática composta por 1% (p/v) Cellulase “Onozuca R- 10” (Yakult Honsha) + 0,2% (p/v) de “Macerozyme R10” (Yakult Honsha) + 0,1% (p/v) de Driselase (Sigma London Chemical Co Ltda) + 5 mM de MES, em meio CPW a 0,6M de manitol em incubação por 10 horas em sistema estacionário, com 96,7% de protoplastos viáveis. No cultivo in vitro, obtiveram- se maiores médias para número de folhas (3,74), tamanho médio das três maiores brotações (9,45 mm), massa fresca (1,23 g) e massa seca (0,15 g) utilizando cultivo em meio líquido. Folhas obtidas do cultivo em meio sólido apresentaram maior espessura. Brotações na ausência de luz apresentaram maior comprimento médio. Maior número e tamanho de brotações (13,3 e 22,94mm) foram obtidos com 0/1 e 0/0,5 de ANA/BAP, respectivamente. Maior número e tamanho da maior raiz (28,07 e 29,07 mm), foi obtido com 1/0 mg L -1 de ANA/BAP.

The Caryocar brasiliense is one of the native fruit species from Cerrado with higher economical, ecological and social importance. In the last decades, large land extensions in the “ Cerrado “ has been used for agricultural system. This fact associated with a natural low regeneration rate has caused the reduction in natural populations of the species. Based on these facts, it is important to optimize the propagation technique for seedling production in order to regulate the production of the species and use it to recover degraded areas. The objective of the present work was to study aspects of the in vitro cultivation of Caryocar brasiliense through calogenesis, organogenesis, somatic embryogenesis and isolation of protoplast. For the induction of somatic embryos and embryogenic calli, combinations of different concentrations of 2,4-D x sucrose and 2,4-D x 2- iP were tested. For embryo development, ABA was tested. For protoplast isolation, two enzymatic solutions, incubation time, manitol concentration and incubation system (stationary and orbital agitation) were tested. For the in vitro cultivation, combinations of BAP x ANA and cinetina x picloran were evaluated. It was also tested, the effect of the cultivation in liquid and solid medium in the absence or presence of light. The results demonstrated that embryos and embryogenic callus can be obtained with 45 days of cultivation as well as embryogenic callus in sub cultivation at 45 days in MS medium supplemented with 60 g L -1 sucrose. 18.32 x 10 5 ±1.18 protoplasts were obtained per gram of in vitro leaf tissue fresh mass with an average diameter of 25.19 ±4.75 μm. 96% of viable protoplasts were obtained using the enzymatic solution composed by 1% (p/v) Cellulase “Onozuca R-10” (Yakult Honsha) + 0.2% (p/v) “Macerozyme R10” (Yakult Honsha) + 0.1% (p/v) Driselase (Sigma London Chemical Co Ltda) + 5 mM MES in CPW medium and maintained in incubation for 10 hours in stationary system. The in vitro cultivation promoted the highest leaf number average (3.74), length average of the three largest shoots (94.5 mm), fresh mass (1.23 g) and dry mass (0.15 g) using cultivation in liquid medium. Leaves obtained in solid medium showed higher thickness. Shoots grown in the absence of light presented higher average length. Higher number and size of shoot (13.3 and 22.94 mm) were obtained with 0/1; 0/0.5 NAA/BAP, respectively. Higher number and higher root size (28.07 and 29.07 mm) were obtained with 1/0 mg L -1 NAA/BAP.